# 역상 HPLC에서 이동상 조성 변화가 분리에 미치는 영향을 예측한 내용으로 옳은 것은?

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> subject: 고성능 액체 크로마토그래피

## 문제

역상 HPLC에서 이동상 조성 변화가 분리에 미치는 영향을 예측한 내용으로 옳은 것은?

비극성 C18 정지상을 사용하고 이동상으로 물-아세토니트릴 혼합액을 쓰는 역상 HPLC 시스템에서, 아세토니트릴 비율을 30%에서 60%로 높였다. 분리 대상은 극성이 서로 다른 화합물 A(log P = 0.5)와 B(log P = 3.2)이다.

## 보기

1. 두 화합물 모두 머무름시간이 짧아지고, A와 B의 분리능이 감소한다. **✔ 정답**
2. 화합물 B의 머무름시간은 길어지고, 화합물 A의 머무름시간은 짧아진다.
3. 두 화합물 모두 머무름시간이 길어지고, A와 B의 분리능이 증가한다.
4. 화합물 A의 머무름시간은 길어지고, 화합물 B의 머무름시간은 짧아진다.
5. 두 화합물 모두 머무름시간이 짧아지고, A와 B의 분리능이 증가한다.

**정답: 1**

## 해설

역상 HPLC에서 정지상(C18)은 비극성, 이동상은 수성-유기 혼합계이다. 유기용매(아세토니트릴) 비율을 높이면 이동상의 용출력(eluting strength)이 증가하여 정지상과 분석물 사이의 소수성 상호작용이 약해진다. 따라서 극성 화합물 A(log P 낮음)와 비극성 화합물 B(log P 높음) 모두 C18 정지상에서 더 빨리 용출되어 머무름시간이 짧아진다. 또한 두 화합물의 머무름인자(k) 차이가 전반적으로 감소하므로 분리능(Rs)도 줄어든다. 선택지 1·4는 방향이 반대이거나 분리능 변화 예측이 틀렸고, 선택지 3·5는 두 화합물의 이동 방향이 서로 반대라고 주장하나, 유기용매 증가는 소수성 상호작용을 일률적으로 약화시켜 두 화합물 모두 같은 방향으로 머무름시간이 변한다.

## 심화 해설

핵심 해설
이 문제는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reversed-Phase HPLC)에서 이동상 조성 변화가 분리에 미치는 영향을 묻고 있어요. 역상 HPLC의 핵심 원리는 "비극성 정지상(C18)과 극성 이동상(물-아세토니트릴) 사이에서 분석물의 소수성(Hydrophobicity) 차이를 이용한 분리"예요. 여기서 아세토니트릴(Acetonitrile)과 같은 유기 용매의 비율을 높이면 이동상의 용출력(Eluting Strength)이 강해져요.

**핵심 개념 분석 (Key Concept)**: log P(옥탄올-물 분배계수)는 화합물의 소수성을 나타내는 지표로, 값이 클수록 비극성이며 C18 정지상과의 소수성 상호작용(Hydrophobic Interaction)이 강해져 오래 머무르게 됩니다. 문제에서 아세토니트릴 비율을 30%에서 60%로 높이는 것은 이동상의 극성을 낮추어(소수성을 높여) 분석물이 정지상에 머무르려는 힘을 약화시키는 거예요. 이는 마치 비누로 기름때를 씻어내는 것처럼, 강한 용출력이 분석물을 정지상에서 밀어내 더 빨리 용출시키는 원리입니다.

**정답 근거 (Answer Rationale)**: 핵심! 유기 용매 비율 증가는 정지상-분석물 간 소수성 상호작용을 일률적으로 감소시키므로, 극성 화합물 A와 비극성 화합물 B 모두 머무름 시간이 짧아집니다. 또한, 용출 속도가 전반적으로 빨라지면서 두 피크 간의 머무름 인자(k') 차이가 줄어들게 되어 분리능(Resolution, Rs)은 감소합니다. 따라서 **"두 화합물 모두 머무름시간이 짧아지고, A와 B의 분리능이 감소한다"**는 1번이 정답입니다.

**오답 분석 (Distractor Analysis)**:
- **보기 2**: 혼동 주의! 유기 용매 비율 증가 시 모든 분석물의 머무름 시간은 감소합니다. 극성 화합물 A의 머무름 시간이 길어진다는 것은 순상 크로마토그래피(Normal-Phase HPLC)의 원리를 혼동한 것입니다.
- **보기 3**: 용출력 증가는 머무름 시간을 단축시키며, 분리능 또한 감소시키는 것이 일반적입니다. 머무름 시간이 길어지고 분리능이 증가하는 것은 유기 용매 비율을 낮추었을 때 나타나는 현상이에요.
- **보기 4**: 유기 용매 비율 변화는 소수성 상호작용을 비특이적으로 약화시키므로, log P 값에 관계없이 모든 분석물의 머무름 시간이 같은 방향(단축)으로 움직입니다. 화합물 A와 B의 이동 방향이 서로 반대라는 것은 잘못된 예측입니다.
- **보기 5**: 머무름 시간이 모두 짧아지는 것은 맞지만, 전반적인 용출 속도 증가로 인해 두 피크가 더 가까워지므로 분리능은 증가하지 않고 감소합니다.

**연관 개념 정리 (Related Concepts)**:

| 파라미터 | 유기 용매 증가 (아세토니트릴 ↑) | 유기 용매 감소 (물 ↑) |
| --- | --- | --- |
| 이동상 극성 | 감소 | 증가 |
| 이동상 용출력 | 증가 | 감소 |
| 머무름 시간 (tR) | 감소 (짧아짐) | 증가 (길어짐) |
| 분리능 (Rs) | 일반적으로 감소 | 일반적으로 증가 |

개념 정리: 역상 크로마토그래피(RPC)에서는 비극성 정지상과 극성 이동상을 사용합니다. 용질의 분리는 주로 이동상의 소수성 반발력과 정지상의 소수성 인력 사이의 평형에 의해 결정됩니다. 이동상의 유기 용매 비율은 이 평형을 조절하는 가장 강력한 도구 중 하나입니다.

한눈에 비교!: 혼동 주의! 순상 HPLC(Normal-Phase)는 극성 정지상(실리카겔)과 비극성 이동상(헥산 등)을 사용하므로, 이동상의 극성을 높이면(예: 에틸아세테이트 첨가) 용출력이 증가합니다. 역상과 순상의 정지상/이동상 극성 및 용출력 변화 방향이 완전히 반대라는 점을 꼭 기억하세요.

암기 팁: **"역상에서는 기름(C18)과 물, 유기용매는 기름때를 씻어내는 비누"**라고 생각하세요. 비누(유기용매)를 많이 넣을수록 기름때(비극성 분석물)가 빨리 씻겨 나갑니다. log P는 기름때의 정도를 나타내며, 값이 클수록(기름때가 심할수록) 더 오래 씻어야 하지만, 비누가 많아지면 결국 다 빨리 씻겨 나갑니다.

국시 빈출 포인트: 약사 국가고시에서 역상 HPLC의 이동상 조성 변화에 따른 머무름 시간과 분리능 예측은 매우 빈번하게 출제됩니다. 특히 log P 값이 다른 두 약물을 예시로 들어, 유기 용매 비율이나 pH 변화에 따른 용출 순서와 분리능 변화를 묻는 문제에 철저히 대비해야 합니다.

기출 변형 주의!: 단순히 머무름 시간 변화뿐 아니라, "이동상의 pH를 낮추면 약산성 약물의 머무름 시간이 어떻게 변할까?"와 같은 문제로도 변형될 수 있습니다. pH가 낮아지면 약산성 약물의 이온화가 억제되어 소수성이 증가하므로 머무름 시간이 길어집니다. 이동상 조성과 pH의 영향을 종합적으로 이해해야 합니다.

## 임상 시나리오

약국/임상 실무 가이드
- **임상 시나리오 (Clinical Scenario)**: 병원 약제부 품질관리실에서 테오필린(Theophylline) 정제의 함량 시험을 위해 역상 HPLC 분석법을 개발하고 있습니다. 분석법 밸리데이션 과정에서 이동상의 아세토니트릴 비율을 25%로 했을 때는 테오필린 피크의 머무름 시간이 8분으로, 전처리 과정에서 완전히 제거되지 않은 부형제 피크와 겹치는 문제가 발생했습니다. 분석 시간을 단축하면서도 부형제 피크와의 완전한 분리를 달성하기 위해 이동상 조성을 최적화하려고 합니다.

- **복약지도 및 중재 전략 (Counseling & Intervention)**: 핵심! 초기 분석 조건(아세토니트릴 25%)에서는 테오필린의 머무름 시간이 길어 분석 효율이 떨어지고, 인접한 불순물 피크와의 분리능도 충분하지 않았습니다. 이동상의 아세토니트릴 비율을 40%로 높이자, 테오필린의 머무름 시간이 3.5분으로 단축되었고 부형제 피크와의 분리능(Rs)이 2.5 이상으로 확보되어 대한민국약전(KP) 및 ICH 가이드라인의 기준을 충족하게 되었습니다. 이처럼 유기 용매 비율을 조절하는 것은 피크의 머무름 시간과 분리능을 제어하는 가장 기본적이면서도 강력한 방법입니다.

- **환자 안전 및 주의사항 (Precautions)**: HPLC 분석법을 개발할 때는 단순히 주성분의 머무름 시간만 보는 것이 아니라, 합성 공정에서 유래할 수 있는 유연물질(Related Substances)이나 분해산물 피크가 주피크와 완전히 분리되는지 반드시 확인해야 합니다. 이는 시스템 적합성 시험(System Suitability Test, SST)의 핵심 항목이며, 의약품의 안전성 및 유효성을 담보하는 품질 관리의 기본입니다.

복약지도 프로토콜: HPLC 분석법 개발 시, 이동상의 유기 용매 비율을 변화시키는 것 외에도 이동상의 pH, 컬럼 온도, 유속 등 다양한 파라미터를 조절하여 최적의 분리 조건을 찾습니다. 특히 이온화 가능한 약물(염기성 또는 산성 약물)의 경우, pH 조절을 통해 머무름 거동을 극적으로 바꿀 수 있습니다.

선배 약사의 한마디: "약사 국가고시에서 분석화학 파트를 공부할 때, 이론만 달달 외우기보다는 '이 원리가 실제 의약품 품질관리에서 어떻게 쓰일까?'를 생각하며 공부하는 것이 중요해요. 단순히 머무름 시간이 짧아진다는 사실만 기억하는 것이 아니라, 유기 용매 비율을 조절하면 왜 그런 현상이 일어나는지 분자 수준의 상호작용을 이해해야, 어떤 문제가 나와도 자신 있게 답을 찾을 수 있답니다!"

## 핵심 개념

- **역상 크로마토그래피(Reversed-Phase Chromatography)** — 비극성 정지상(C18)과 극성 이동상(물-유기용매)을 사용하여, 주로 소수성 상호작용에 의해 시료 성분을 분리하는 크로마토그래피.
- **분배계수(Partition Coefficient, log P)** — 특정 화합물이 옥탄올(비극성)과 물(극성)의 두 비혼합성 용매 사이에서 평형을 이룰 때의 농도 비율에 상용로그를 취한 값. 값이 클수록 소수성이 크다.
- **용출력(Eluting Strength)** — 이동상이 정지상으로부터 용질을 밀어내어 이동시키는 능력. 역상 HPLC에서는 유기 용매의 비율이 높을수록, 또는 유기 용매의 극성이 낮을수록 용출력이 크다.
- **머무름 시간(Retention Time, tR)** — 시료가 컬럼에 주입된 후부터 검출기에서 최대 피크로 나타날 때까지 걸리는 시간. 분석물과 정지상의 상호작용이 강할수록 길어진다.
- **분리능(Resolution, Rs)** — 두 성분이 크로마토그래피 컬럼에서 얼마나 잘 분리되었는지를 나타내는 척도. 머무름 시간의 차이와 피크 폭의 비율로 계산되며, Rs 값이 클수록 분리가 잘 된 것이다.

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