# H&E 염색에서 분별(differentiation) 단계에 사용되는 시약과 그 목적의 연결로 옳은 것은?

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> subject: H&E 염색

## 문제

H&E 염색에서 분별(differentiation) 단계에 사용되는 시약과 그 목적의 연결로 옳은 것은?

## 보기

1. 염산-알코올 용액을 사용하여 과잉 에오신을 제거한다.
2. 탄산리튬 용액을 사용하여 에오신을 청색으로 전환시킨다.
3. 염산-알코올 용액을 사용하여 과잉 헤마톡실린을 제거한다. **✔ 정답**
4. 에탄올 용액을 사용하여 헤마테인을 산화시킨다.
5. 암모니아수를 사용하여 과잉 헤마톡실린을 제거한다.

**정답: 3**

## 해설

분별(differentiation) 단계에서는 묽은 염산-알코올(0.5~1% HCl in 70% ethanol) 용액을 사용하여 조직에 과잉 결합된 헤마톡실린(헤마테인-매염제 복합체)을 선택적으로 제거하고, 핵만 선명하게 남긴다. 이후 블루잉(blueing) 단계에서 암모니아수나 탄산리튬 용액으로 pH를 높여 핵을 청자색으로 발색시킨다.

## 심화 해설

핵심 해설
이 문제는 조직병리학에서 가장 기본이 되는 H&E 염색(Hematoxylin and Eosin Stain)의 각 단계별 사용 시약과 그 목적을 정확히 이해하고 있는지 묻는 문제예요. 특히 혼동 주의! 분별(Differentiation)과 블루잉(Blueing) 단계를 서로 바꿔서 혼동하면 안 됩니다.

**핵심 개념 분석 (Key Concept)**
H&E 염색은 크게 4단계로 진행됩니다: 탈파라핀 및 함수 → 핵 염색(헤마톡실린) → 분별 → 블루잉 → 세포질 염색(에오신) → 탈수, 투명, 봉입.
- **헤마톡실린(Hematoxylin)**: 산화되어 헤마테인(Hematein)이 된 후, 매염제(Mordant, 주로 명반)와 결합하여 양전하를 띤 헤마테인-매염제 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 세포핵의 음전하를 띤 DNA와 정전기적 인력으로 결합합니다.
- **분별(Differentiation)의 목적**: 헤마톡실린 염색 후, 조직 전체에 과잉 결합된 헤마테인-매염제 복합체를 선택적으로 제거하여 핵만 선명하게 염색되도록 하는 과정입니다. 사용되는 시약은 **묽은 염산-알코올 용액(0.5~1% HCl in 70% ethanol)**입니다. 산성 용액이 헤마테인-매염제 복합체를 분해하고 알코올이 탈수 작용을 하여 핵 외의 비특이적 염색을 제거합니다.

**정답 근거 (Answer Rationale)**
③번 염산-알코올 용액을 사용하여 과잉 헤마톡실린을 제거한다가 정답입니다. 핵심! 분별 단계는 헤마톡실린 염색 직후에 시행되며, 묽은 염산-알코올 용액이 과잉 헤마톡실린(헤마테인-매염제 복합체)을 선택적으로 제거하는 것이 핵심 원리입니다.

**오답 분석 (Distractor Analysis)**
①번: 에오신(Eosin) 염색 후에는 분별 단계가 없습니다. 에오신은 탈수 과정에서 과잉 염색이 자연스럽게 제거되며, 별도의 산성 분별액을 사용하지 않습니다.
②번: 혼동 주의! 탄산리튬 용액은 분별이 아닌 **블루잉(Blueing)** 단계에서 사용됩니다. 분별로 인해 산성화된 핵을 염기성 용액으로 중화시켜 헤마테인-매염제 복합체를 불용성의 청자색으로 발색시키는 역할을 합니다.
④번: 에탄올은 탈수(Dehydration) 단계에서 사용됩니다. 헤마테인은 헤마톡실린이 산화된 형태이며, 에탄올은 산화제가 아닙니다.
⑤번: 암모니아수 역시 **블루잉(Blueing)** 단계에 사용되는 대표적인 시약입니다. 과잉 헤마톡실린을 제거하는 것이 아니라 pH를 높여 핵 색을 청자색으로 변화시킵니다.

**연관 개념 정리 (Related Concepts)**
- **블루잉(Blueing) 시약**: 암모니아수(Ammonia water), 탄산리튬(Lithium carbonate), 약알칼리성 수돗물(Tap water)
- **분별액(Differentiator)**: 묽은 염산-알코올(0.5~1% HCl in 70% EtOH)
- **에오신 후 분별**: 일반적으로 시행하지 않음. 과잉 에오신은 95%, 100% 에탄올 탈수 과정에서 제거됨.

개념 정리
H&E 염색 핵심 흐름: 헤마톡실린 염색(핵 청자색) → 분별(염산-알코올로 과잉 헤마톡실린 제거) → 블루잉(암모니아수/탄산리튬으로 핵 발색 안정화) → 에오신 염색(세포질/적혈구 분홍색) → 탈수·투명·봉입

한눈에 비교!

| 단계 | 사용 시약 | 목적 |
| --- | --- | --- |
| 분별(Differentiation) | 묽은 염산-알코올 | 과잉 헤마톡실린 제거 (핵 선택적 염색) |
| 블루잉(Blueing) | 암모니아수, 탄산리튬 | pH 상승, 헤마테인-매염제 복합체 불용성화 및 청자색 발색 |
| 탈수(Dehydration) | 에탄올(70%, 95%, 100%) | 조직 내 수분 제거 (과잉 에오신 제거 부수 효과) |

핵심 검사 포인트
H&E 염색의 성패는 분별 시간과 블루잉 조건에 달려 있습니다. 분별이 너무 오래되면 핵 염색이 너무 약해지고, 너무 짧으면 배경이 지저분해집니다. 매 염색 배치마다 대조 슬라이드(Control slide)를 포함시켜 분별 시간을 최적화하는 것이 표준 작업 절차(SOP)입니다.

암기 팁
"산(酸)은 분별, 염(鹽)기(碱)는 블루잉"으로 외워보세요. 산성 시약(염산-알코올)은 과잉 염색을 분별하고, 염기성 시약(암모니아수, 탄산리튬)은 핵을 예쁘게 블루잉(blueing)합니다.

국시 빈출 포인트
H&E 염색의 분별 단계 시약(염산-알코올)과 블루잉 단계 시약(암모니아수, 탄산리튬)을 서로 바꿔서 묻는 선택지가 자주 출제됩니다. 반드시 각 단계의 시약과 목적을 연결 지어 암기하세요.

기출 변형 주의!
"분별액으로 1% 염산-알코올을 사용하는 이유는 무엇인가요?"라는 식으로 묻거나, "블루잉 단계를 생략하면 어떤 결과가 나타나나요?" (핵이 갈색 또는 적자색으로 보이고 에오신과 대비가 약해짐)와 같이 결과 변화를 묻는 문제로 변형될 수 있습니다.

## 임상 시나리오

검사실 실무 가이드
**검사실 시나리오 (Laboratory Scenario)**
간 조직 생검(Liver biopsy) 검체를 자동조직처리기(Automated Tissue Processor)로 처리한 후, 박절기(Microtome)로 4μm 두께의 파라핀 절편을 만들었습니다. 이제 H&E 자동염색기(Automated H&E Stainer)를 사용하여 염색을 시작합니다.

**검사 수행 및 결과 보고 전략 (Testing & Reporting)**
1. **검체 접수 확인**: 환자 정보(이름, 등록번호, 검체 번호)와 슬라이드 라벨을 확인하고, 블록과 슬라이드가 일치하는지 대조합니다.
2. **탈파라핀 및 함수**: 자일렌(Xylene)으로 파라핀을 제거하고, 단계별 에탄올(100% → 95% → 70% → 증류수)로 함수시킵니다.
3. **헤마톡실린 염색**: 핵 염색을 위해 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxylin)에 일정 시간(약 5분) 침적합니다.
4. **분별 단계**: 핵심! 염색 후 슬라이드를 묽은 염산-알코올 용액(0.5% HCl in 70% EtOH)에 3~5회 담갔다 뺍니다. 이때 현미경으로 분별 상태를 확인하며 시간을 조절합니다.
5. **블루잉 단계**: 흐르는 수돗물(Tap water) 또는 암모니아수에 1~2분 담가 핵이 청자색으로 변하는 것을 확인합니다.
6. **에오신 염색 및 탈수**: 에오신 Y(Eosin Y)에 30초~1분 염색 후, 95% 및 100% 에탄올로 탈수합니다.
7. **투명 및 봉입**: 자일렌으로 투명화(Clearing)한 후 합성수지(DPX, Permount 등)로 봉입(Mounting)합니다.
8. **결과 보고**: 완성된 슬라이드를 병리의사(Pathologist)가 판독할 수 있도록 전달합니다. 염색 품질이 불량하면(예: 핵이 너무 옅거나 배경이 진한 경우) 재염색을 진행합니다.

**검체 안전 및 주의사항 (Precautions)**
- 자일렌과 같은 유기용매는 발암성이 있으므로 **흄후드(Fume hood)** 내에서 사용하고, 폐기물은 별도로 수거하여 처리합니다.
- 염산-알코올 용액은 피부와 점막에 자극성이 있으므로 장갑과 보안경을 착용합니다.
- 분별 시간은 검체 종류(간, 신장, 피부 등)와 두께에 따라 달라지므로, 반드시 예비 염색(Trial staining)을 통해 최적 조건을 설정합니다.

검사실 표준작업절차
H&E 염색 SOP 필수 체크리스트:
- [ ] 대조 슬라이드(Control slide) 포함 여부 확인
- [ ] 염색 시약 유효기간 및 교체 일자 점검
- [ ] 분별액(염산-알코올) 농도 및 교체 주기 기록
- [ ] 염색 후 핵과 세포질 대비(Nuclear vs Cytoplasmic contrast) 현미경 검사
- [ ] 재염색 기준 설정 (예: 핵이 전반적으로 옅거나 배경이 청색인 경우)

선배 임상병리사의 한마디
"임상병리사는 환자의 진단과 치료 방향을 결정짓는 검사 결과, 그 정확성을 책임지는 전문가예요! 국시 공부할 때 단순히 텍스트만 외우지 말고 '내가 지금 검사실에서 이 검체를 받았다면 당장 어떤 검사를 우선해야 할까, 정도관리에서 이상이 발견되면 어떻게 대응해야 할까?'를 머릿속으로 시뮬레이션해 보세요!"

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