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기기가 내놓은 흡광도, 회전수, 세어 둔 세포 수는 식을 거쳐야 농도와 수치가 됩니다.
이 단원의 흐름 · 흡광도가 농도에 비례하는 이유 → 표준곡선과 공시료 보정 → 원심력과 회전수의 관계 → 혈구계산판의 부피 계산 순서로 읽습니다.
분광광도계는 빛이 용액을 통과하면서 얼마나 줄었는지를 잽니다. 투과율 T가 낮을수록 빛이 많이 흡수된 것이고 흡광도는 A = −log T = 2 − log(%T)입니다. 투과율 50%는 A = 0.301, 투과율 10%는 A = 1.000입니다. 로그를 쓰는 이유는 농도가 일정량 늘 때마다 투과된 빛이 같은 비율로 곱해져 줄어들기(지수적으로 감소하기) 때문입니다. 예를 들어 투과율 50%인 용액의 농도를 두 배로 하면 투과율은 25%가 됩니다. 로그를 취해야 농도와 흡광도가 직선 관계가 됩니다.
Beer-Lambert 법칙은 A = ε·b·c입니다. ε는 물질마다 정해진 몰흡광계수, b는 빛이 지나는 큐벳의 길이(보통 1 cm), c는 몰 농도입니다. 따라서 흡광도와 ε, b를 알면 c = A ÷ (ε·b)로 농도를 구합니다. 이 비례는 농도가 지나치게 높으면 깨지므로 장비·시약마다 정해진 선형 범위(흡광도 상한)를 넘는 검체는 희석해 다시 측정합니다.
실제 검사에서는 ε를 일일이 쓰지 않고 농도를 아는 표준액과 비교합니다. 같은 조건에서 표준액(Cs, As)과 검체(Au)를 측정하면 Cu = Au ÷ As × Cs입니다. 시약 자체가 내는 흡광도가 있으면 공시료 값을 먼저 빼서 (Au − Ab) ÷ (As − Ab) × Cs로 계산합니다. 공시료를 빼지 않으면 시약 색 때문에 농도가 실제보다 높게 나옵니다.
그림 2-1. 표준곡선에서 검체 농도를 읽는 과정 — 표준액 점들이 만든 직선에서 검체의 흡광도를 가로로 옮겨 농도를 읽는 순서를 확인합니다.
표준곡선이 A = aC + b로 주어지면 C = (A − b) ÷ a입니다. 절편 b는 흡광도 단위이므로 구한 농도에서 빼지 않고 흡광도 단계에서 먼저 뺍니다. 검체를 희석해 측정했다면 마지막에 희석배수를 곱합니다.
원심기의 설정값은 rpm이지만 검체가 받는 힘은 상대원심력 RCF(×g)입니다. RCF = 1.118×10⁻⁵ × r(cm) × rpm²입니다. 같은 rpm이라도 반경이 큰 원심기에서 더 큰 힘을 받는 이유는 회전 반경이 클수록 같은 각속도에서 선속도가 커지기 때문입니다. 그래서 프로토콜에는 rpm보다 ×g를 쓰는 편이 기기가 달라져도 재현됩니다.
rpm을 두 배로 올리면 RCF는 4배가 됩니다. 이 제곱 관계는 rpm 변경 문항에서 가장 많이 틀리는 지점입니다. 반대로 목표 RCF가 정해져 있으면 rpm = √(RCF ÷ (1.118×10⁻⁵ × r))로 설정값을 구합니다. 반경은 회전축에서 튜브 바닥까지의 거리이므로 지름을 넣으면 2배로 계산됩니다.
혈청 분리에서 속도를 높이면 분리가 빨라지는 대신 용혈이나 세포 파괴의 위험이 커지므로 검사별 지침의 ×g와 시간을 따릅니다.
그림 2-2. 원심기 회전축과 반경 — RCF 식의 r이 회전축에서 튜브 바닥까지의 거리라는 점을 그림으로 확인합니다.
혈구계산판의 대구역은 가로세로 1 mm이고 덮개유리와의 간격(깊이)은 0.1 mm이므로 대구역 하나의 부피는 0.1 mm³ = 0.1 µL입니다. 세포 수는 센 개수 ÷ 센 부피(µL) × 희석배수로 구합니다. 이 식 하나로 혈구 계산이 풀립니다. 다만 센 부피가 구역마다 다르므로 부피 계산에서 실수가 납니다.
백혈구는 네 모서리 대구역을 셉니다. 부피는 0.1 × 4 = 0.4 µL입니다. 20배 희석 혈액에서 합계 48개를 셌다면 48 ÷ 0.4 × 20 = 2,400/µL입니다. 적혈구는 중앙 대구역의 25개 중구역 중 5개(네 모서리와 중앙)를 셉니다. 중구역 하나는 1/25 mm² = 0.04 mm²이므로 5개는 0.2 mm², 깊이를 곱한 부피는 0.02 µL입니다. 200배 희석에서 480개라면 480 ÷ 0.02 × 200 = 4,800,000/µL입니다. 혈소판은 중앙 대구역 전체 0.1 µL를 셉니다.
적혈구와 백혈구를 세는 구역이 다른 이유는 적혈구 수가 백혈구보다 약 1,000배 많아서 같은 넓이를 세면 숫자가 너무 많기 때문입니다. 부피를 잘못 잡으면 결과가 5배, 10배 틀어지므로 어떤 구역을 몇 개 셌는지를 먼저 적습니다.
그림 2-3. 혈구계산판 구역과 세는 위치 — 백혈구는 네 모서리 대구역, 적혈구는 중앙 대구역의 중구역 5개를 센다는 위치를 확인합니다.
망상적혈구는 적혈구 1,000개당 개수로 비율을 내며, 빈혈이 있으면 비율이 실제보다 높게 보이므로 헤마토크릿/45를 곱해 보정합니다. 보정 비율이 낮게 남으면 골수 반응이 부족하다고 해석합니다.
식과 상수는 임상화학·임상혈액학 교재의 일반 공식입니다. 혈구계산판 규격(1 mm, 깊이 0.1 mm)과 세는 구역은 일반적인 Neubauer 형식이며 기관별 방법서에 따라 달라질 수 있어 확인이 필요합니다.
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