(1) 박층크로마토그래피의 원리와 조건

① TLC 판과 Rf 값

박층크로마토그래피(TLC) 실리카겔 GF254 판은 254 nm에서 형광을 내어 흡수 성분이 어두운 반점으로 보인다.

Rf 값과 재현성은 이동거리를 전개용매 상승거리로 나눈 0~1 값이며, 극성 고정상이라 극성이 클수록 흡착이 강해 Rf가 작아진다.

② 전개용매 조성과 챔버 포화

전개용매 조성이 극성일수록 순상 실리카겔에서 용리력이 커져 Rf가 커지고, 챔버 포화가 부족하면 가장자리 효과로 Rf가 흔들린다.

여과지로 챔버를 포화시키고 전개 거리 · 온도를 일정하게 두며, 점적량이 과하면 반점이 번져 분리도가 떨어진다.

③ 평면법·전기영동 원리 비교표

(2) 발색과 평면법의 확장

① 발색시약과 생약 확인시험

발색시약(요오드증기, 황산, 닌히드린, 드라겐도르프, 안이스알데하이드-황산) : 요오드증기는 비특이적 · 황산 가열은 탄화 · 닌히드린은 아미노산 · 아민 · 드라겐도르프는 알칼로이드 · 안이스알데하이드-황산은 테르펜 · 사포닌

KP · KHP 생약 확인시험에서의 TLC는 표준품과 시료 반점의 위치와 색을 비교한다.

② HPTLC와 종이크로마토그래피

고성능 TLC(HPTLC)와 덴시토메트리를 결합하면 반점의 흡광도나 형광 세기를 스캔해 정량할 수 있고, 입자가 작고 층이 얇아 재현성이 높다.

종이크로마토그래피는 셀룰로스 결합수를 고정상으로 쓰는 분배형이나 활용도는 낮다.

(3) 전기영동과 단백질 분리

① 모세관전기영동과 MEKC

모세관전기영동(CE)과 전기삼투류가 합쳐져 이동속도가 정해지며, 전기삼투류가 음극 방향으로 강해 양이온 · 중성 · 음이온 순으로 검출된다.

미셀동전기크로마토그래피(MEKC)는 SDS 미셀을 유사 고정상으로 넣어 중성물질까지 분리한다.

② 단백질과 바이오의약품 분리

SDS-PAGE는 음전하를 균일하게 씌워 전하 차이를 없애 분자량이 작을수록 빨리 이동하고, 등전점전기영동(바이오의약품)은 순전하 0인 등전점에 멈춘다.

겔여과는 분자 크기, 이온교환에 의한 단백질 분리는 표면 전하 차이를 이용한다.