part5. 면역조직화학과 전자현미경
(1) 원리와 방법
① 목적
- 미분화 세포의 기원 확인, 효소·호르몬·종양표지자 검출, 암종과 육종 구별, 양성·악성 감별에 이용
② 주요 방법
| 방법 |
원리·특징 |
| 면역형광법(IF) |
형광색소 표지 항체, 동결절편, IgG·IgA·IgM·C3·C4 검출 |
| PAP법 |
퍼옥시다아제-항퍼옥시다아제, 1차·2차·PAP 항체 3단계 |
| ABC법 |
아비딘-바이오틴 복합체, PAP보다 민감도 높음, 현재 많이 사용 |
| LSAB법 |
정제 이차항체 + 스트렙타비딘-효소 직접 결합, ABC보다 더 민감·빠름 |
📌 실전 체크 포인트!
민감도 순서: LSAB > ABC > PAP > 직접법
ABC법은 아비딘-바이오틴의 강한 친화력 이용(아비딘 1개에 바이오틴 4개 결합)
(2) 항원 복원과 발색
① 항원 복원(Antigen retrieval)
- 포르말린 고정·파라핀 처리 과정에서 항원이 단백 응고·변성으로 덮임
- 복원 방법: 마이크로웨이브·고압증기·효소 처리로 항원을 표출시킴
② 탈파라핀·발색
- 탈파라핀 후 함수, 내인성 퍼옥시다아제 차단, 1차항체 반응, 발색(DAB·AEC) 순서로 진행
📌 실전 체크 포인트!
항원 복원 필요 이유: 포르말린 고정으로 교차결합된 단백질이 항원 부위를 가림
DAB 발색: 갈색, AEC 발색: 적색
(1) 투과전자현미경 표본 제작
① 과정
- 시료 채취·세절 → 고정 → 탈수 → 치환 → 침투 → 포매 → 중합 → 초박절 → 그리드 수거 → 전자염색 → 검경
② 각 단계 특징
- 검체는 채취 후 고정까지 1~2분 이내, 고정액 냉장(4℃) 보관, 1 ㎣ 크기로 세절
- 전고정: 2.5% 글루타르알데히드(0.1 M 인산완충액, pH 7.4), 4℃ 1~2시간
- 후고정: 1% 사산화오스뮴(osmium tetroxide), 4℃ 90~120분
- 치환제: 산화프로필렌(propylene oxide)
- 침투제·포매제: 에폭시 수지(epoxy resin, 비수용성)
- 중합: 38℃ 12시간 → 45℃ 12시간 → 60℃ 48시간
- 초박절: 60~90 nm, 초미세박절기(ultramicrotome), 다이아몬드·유리 칼 사용
- 그리드: 직경 3 ㎜ 구리 그리드, 광학현미경 슬라이드에 해당
- 전자염색(이중염색): 아세트산우라닐(uranyl acetate) + 구연산납(lead citrate)
📌 실전 체크 포인트!
전고정: 글루타르알데히드 / 후고정: 사산화오스뮴
전자현미경 절편 두께: 60~90 nm / 광학현미경: 약 5 ㎛
(2) 탈회
① 목적과 원리
- 석회화 조직(뼈·연골) 내 칼슘염을 제거하여 조직을 연화하는 과정
- 탈회 순서: 고정 → 탈회 → 중화 → 수세
② 탈회법
- 5% 질산(nitric acid): 가장 많이 사용, 오래된 질산은 아질산(황색)으로 변해 조직을 착색하므로 매일 교체
- 1% 우레아 첨가 시 아질산 변환 억제
- 5% 개미산(formic acid): 약산 탈회제, 치밀골에는 부적합
- 골수조직: 부앙(Bouin) 고정 권장
- 중화액: 5% 탄산리튬(lithium carbonate)
📌 실전 체크 포인트!
가장 많이 사용하는 탈회법: 5% 질산 / 골수: 부앙 고정
탈회 완료 확인: 뼈 표면 기포(CO₂)가 없어지면 완료 의심, 방사선 촬영으로 확인